单细胞转录组测序

近年来，随着科学技术水平的更新换代，越来越多的单细胞技术得到了发展。如人类细胞图谱、小鼠细胞图谱、小鼠RNA图谱、小鼠ATAC图谱和植物细胞图谱等大型项目，已经产生了大量单细胞组学数据。通过空间转录组学和单细胞多组学，甚至可以解读空间动态多级调控机制。这些单细胞技术在肿瘤学、辅助生殖、胚胎发育和植物育种等领域有许多成功的应用。单细胞测序通常包括单细胞基因组测序，单细胞表观测序，以及单细胞转录组测序。我们这里以单细胞转录组测序（scRNA-seq）为例来给大家进行介绍。

单细胞测序的应用

在已经拥有RNA-Seq测序技术的前提下，我们为什么还要进行单细胞测序？单细胞测序技术之所以重要并被广泛研究和应用，主要是因为它具有以下几个关键的优势和目的：

➣  揭示细胞异质性：在传统的群体细胞测序中，只能获得细胞群体的平均基因表达水平，这会掩盖细胞间的个体差异。单细胞测序可以揭示细胞群体内部的异质性，识别不同的细胞亚群和状态。

➣  深入理解疾病机制：单细胞测序有助于深入理解复杂疾病的发病机制，如肿瘤的微环境、不同细胞类型的相互作用以及疾病进展过程中的细胞动态变化。

➣  精确诊断和治疗：通过对单个细胞的基因表达和遗传变异进行分析，可以为疾病提供更精确的诊断，并有助于开发个性化的治疗方案。

➣  细胞发育和分化研究：单细胞测序技术可以追踪细胞分化过程中的基因表达变化，揭示干细胞分化为特定细胞类型的分子机制。

➣  免疫学研究：单细胞测序有助于研究免疫细胞的多样性和功能，理解免疫应答的复杂性，为疫苗开发和免疫治疗提供信息。

➣  神经科学：在神经科学领域，单细胞测序可以揭示不同类型神经元的基因表达特征，增进对大脑功能和神经退行性疾病的理解。

➣  微生物群落研究：单细胞测序技术可以分析微生物群落中的物种多样性和功能，有助于环境科学和生态学研究。

➣  提高研究分辨率：单细胞测序提供了一种高分辨率的方法来研究生物学问题，可以观察到传统方法无法检测到的细微变化。

➣  发现新的生物标记物：通过分析单个细胞的基因表达，可以发现与疾病相关的新的生物标记物，为早期诊断和治疗提供可能。

➣  推动精准医疗：单细胞测序技术的发展推动了精准医疗的进步，使得医疗干预可以更精确地针对个体的细胞特征。

总之，单细胞测序技术因其能够提供细胞层面的详细和全面信息，已成为现代生物学和医学研究中不可或缺的工具。研究单细胞测序的方法有很多，每种单细胞测序技术的实验流程都有其特定的步骤和特点。我们通过以下是几种常见单细胞测序技术来为大家进行相应的介绍：

• Smart-seq2

★  原理：对单个细胞的mRNA进行全转录组的扩增和测序。

★  优点：提供全长转录组信息，适合于低通量、高精度的研究。

★  缺点：通量较低，成本较高，不适合大规模样本分析。

★  应用场景：适用于需要全长mRNA信息的研究，如可变剪接事件分析、小样本量的细胞状态研究。

SMART-Seq2实验原理

• 10X Genomics Chromium

★ 原理：基于微流控技术和油包水乳液的微滴技术，每个微滴包含一个细胞和反应所需的组分，进行cDNA合成和扩增。

★ 优点：高通量，可同时处理大量细胞；使用UMI技术，减少PCR扩增偏倚。

★ 缺点：成本较高；数据量较大，需要较强的计算资源。

★ 应用场景：适用于需要大规模单细胞分析的研究，如肿瘤异质性、免疫细胞状态分析等。

★ 实验流程：

1. 细胞分离与装载：将单个细胞分离并通过微流控技术装载到芯片上。

2. 乳液滴生成：形成油包水乳液滴，每个乳液滴包含一个细胞和反应组分。

3. 细胞裂解与cDNA合成：在乳液滴内进行细胞裂解和cDNA合成。

4. 文库构建：cDNA进行扩增和标记，构建测序文库。

5. 测序：使用Chromium平台和Illumina测序技术进行测序。

6. 数据分析：包括数据解包、比对、定量、聚类分析等。

10× Genomics实验原理

• Drop-seq

★ 原理：使用微流控技术，将单个细胞与微珠结合，微珠带有独特的barcode，用于区分不同细胞的mRNA。

★ 优点：高通量，成本效益高；适用于稀有细胞类型的分析。

★ 缺点：可能存在较高的dropout率（在单细胞测序（single-cell sequencing）中，"Dropout"率是指在测序过程中，由于各种原因导致某些基因或转录本没有被检测到的现象。），即某些基因在测序中未被检测到。

★ 应用场景：适合于大规模的细胞状态和类型的分类研究。

★ 实验流程：

1. 细胞悬液制备：制备细胞悬液并通过微流控技术进行操作。

2. 微珠装载：细胞与带有独特barcode的微珠结合。

3. 乳液滴生成：形成包含细胞和微珠的乳液滴。

4. 细胞裂解与cDNA合成：在乳液滴内进行细胞裂解和cDNA合成。

5. 文库构建与扩增：构建测序文库并进行PCR扩增。

6. 高通量测序：进行高通量测序。

7. 数据分析：包括barcode解复用、比对、定量、聚类分析等。

Drop-seq实验原理

• Micro-well

★ 原理：通过微孔板技术，每个微孔捕获一个细胞，进行细胞裂解和cDNA合成。

★ 优点：操作简便，成本相对较低。

★ 缺点：通量受限于微孔板的孔数，不适合超大规模样本。

★ 应用场景：适合于中小规模的单细胞测序，如特定细胞类型的功能研究。

★ 实验流程：

1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。

2.细胞分配：将细胞分配到微孔板的每个孔中，理想情况下每个孔一个细胞。

3.细胞裂解与cDNA合成：在孔中进行细胞裂解和cDNA合成。

4.文库构建：构建测序文库。

5.高通量测序：进行高通量测序。

6.数据分析：包括数据质控、比对、定量、差异表达分析等。

Micro-well实验原理

• SPLiT-seq

★ 原理：结合了微流控技术和微孔技术，通过物理分割单个细胞，进行测序。

★ 优点：适用于有限的细胞数量，可以结合细胞表面标记进行分析。

★ 缺点：技术操作复杂，需要特定的设备和条件。

★ 应用场景：适用于有限数量的细胞样本，需要结合细胞表面标记的研究。

★ 实验流程：

1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。

2.细胞分配：将细胞分配到微孔板的每个孔中。

3.物理分割：物理分割每个孔以确保每个孔中只有一个细胞。

4.细胞裂解与cDNA合成：在孔中进行细胞裂解和cDNA合成。

5.文库构建：构建测序文库。

6.高通量测序：进行高通量测序。

7.数据分析：进行数据质控、比对、定量和聚类分析。

SPLiT-seq实验原理

• MARS-seq

★ 原理：基于微流控技术，通过微滴包裹单个细胞，进行mRNA捕获和测序。

★ 优点：能够提供单细胞水平的基因表达数据。

★ 缺点：可能存在较高的drop out率和基因检测的不稳定性。

★ 应用场景：适用于需要中等通量单细胞测序的研究。

★ 实验流程：

1.细胞悬液制备：制备细胞悬液。

2.微流控技术：使用微流控技术将单个细胞封装在微滴中。

3.细胞裂解与cDNA合成：在微滴中进行细胞裂解和cDNA合成。

4.文库构建：构建测序文库。

5.高通量测序：进行高通量测序。

6.数据分析：进行数据质控、比对、定量和聚类分析。

MARS-seq实验原理

每种技术的实验流程都旨在从单个细胞中获取遗传信息，并将其放大到足以进行高通量测序的水平。数据分析是单细胞测序的关键部分，需要专业的生物信息学工具和方法来处理和解释大量的数据。

Smart-seq2技术作为常用的单细胞RNA测序技术之一，它具有一些独特的优势，这些优势在某些研究场景中具有不可替代性：

1.全长转录组测序：

Smart-seq2可以提供单个细胞的全长cDNA序列，这意味着可以获得完整的mRNA信息，包括所有外显子和剪接变体。这对于鉴定和分析可变剪接事件至关重要。其他技术可能只能提供部分转录本信息，无法全面了解剪接模式。

2.低dropout率：

相比于一些基于标签的方法（如Drop-seq或10X Genomics），Smart-seq2通常具有更低的dropout率，这意味着较少的基因表达信息在测序中被遗漏。在研究稀有细胞类型时，确保所有基因表达事件都能被捕获是非常重要的。Smart-seq2较低的dropout率意味着即使是低丰度的转录本也更有可能被检测到。

3.适用于稀有或珍贵样本：

由于Smart-seq2可以提供高质量的全长转录组数据，它特别适合用于那些难以获得大量细胞或样本非常珍贵的研究。

4.高灵敏度和准确性：

Smart-seq2技术能够检测到低丰度的转录本，并且由于其较低的dropout率，它在定量基因表达方面具有较高的准确性。

5.可变剪接分析：

由能够获得完整的转录本序列，Smart-seq2特别适合于研究可变剪接事件，这对于理解基因调控和功能至关重要。

6.适用于小规模样本：

Smart-seq2技术适合于研究少量细胞，例如在研究特定类型的细胞或组织时，这可能是一个重要的优势。例如，可研究的神经元样本数量有限时，那么选择一种能够提供最全面信息的技术变得尤为重要。Smart-seq2适合这种情况，因为它可以从少量细胞中捕获完整的转录组信息。

7.技术成熟：

Smart-seq2是一种较早开发的单细胞测序技术，因此拥有更多的文献支持和成熟的实验流程。

全长转录组扩增试剂盒TransNGS^® Whole Transcriptome Amplification Kit (KC921) 以 WTA Oligo (dT) 为逆转录引物，并应用合成效率高、且具有模板置换活性的逆转录酶在 cDNA 的 3’ 端添加一段特殊序列，从而得到全长 cDNA 产物。可兼容多种细胞和组织类型，适用于 RNA 含量各异的细胞材料。一个单细胞文库通常可以获得 10-60 ng 的全长转录组扩增产物。

产品特点

• 细胞类型兼容性强，可适用于 RNA 含量较低的细胞（如免疫细胞）

• 组织类型兼容性强，可适用于较难解离的组织（如脑组织）

• 单个细胞文库建库产量高，峰型优异，且有效检出基因（FPKM>1）的数目高

• 样本兼容体积高达 6 μl，可适配不同浓度 RNA 或不同数量细胞的扩增

适用范围

• 1-10⁵ 个哺乳动物细胞或无细胞壁结构的真核细胞（如原生质体）

• 10 pg-100 ng 总 RNA（包含有poly (A) 序列的 mRNA）

实验数据

cDNA 产物长度提升，完整度更好

对不同细胞数的 HeLa 细胞、不同起始量烟草 RNA 和不同类型细胞（1000 cells）进行全长 cDNA 扩增后建库，文库峰型结果显示， TransGen 产品 cDNA 产物长度更长。

不同起始量细胞建库

不同起始量RNA建库

不同类型细胞建库

rRNA占比低

使用 TransGen 产品对不同细胞数的 HeLa 细胞、不同起始量烟草 RNA 和不同类型细胞（1000 cells）进行全长 cDNA 扩增后进行 Tn5 建库测序，测序结果显示， rRNA 占比低，数据质量高。

有效基因检测数高

使用 TransGen 产品对不同细胞数的 HeLa 细胞、不同起始量烟草 RNA 和不同类型细胞（1000 cells）进行全长 cDNA 扩增后进行 Tn5 建库测序，测序结果显示，测序数据质量高，有效基因检出数高。

产品信息