多平台、多方法DNA文库制备

自DNA被证明是生命体的遗传物质以来，科学家们对DNA的探索热情愈加高涨。1953年沃森和克里克发现DNA分子双螺旋结构，让人类对生命的认识有了重大的突破，从而带动了DNA测序技术的大发展。

● DNA测序技术的发展里程碑

从1977年第一代测序技术（Sanger法）到2005年Roche公司推出第一台基于焦磷酸测序的二代测序仪开始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，再到2018年MGISEQ-T7超高通量测序仪，测序技术至今已经历了四十多年的技术发展过程。

注：图片来源于网络

● 二代测序技术平台

第二代测序技术也叫高通量测序技术（NGS），其核心原则是边合成边测序。二代测序主要特点是一次能对几十万甚至几百万条DNA序列进行同时测定，使转录组测序及基因组深度测序变得高效、便捷，在保持高准确性的同时降低了测序成本，提高了测序的速度；但其测序的理论基础仍然建立在PCR扩增的基础之上，从而会引入PCR扩增带来的偏差，而且读长较短的缺点。现有的技术平台主要包括Illumina公司的Hiseq平台、Thermo fisher公司的Ion Torrent平台和华大MGISEQ平台，其中市场占比中illumina测序仪在全球的占有率高达83.9%。

illumina测序原理（来源：illumina官网）

随着高通量测序技术的飞速发展，对测序质量和通量的要求越来越高，二代测序主要包括文库构建、上机测序、数据输出这几个流程。其中，DNA文库构建是二代测序技术的基础，高效简洁的建库方法可以提高整个测序流程的效率，其基本原理就是将待测样本片段化成小片段，再在其两端加上接头。根据样本片段化方式及添加接头方式的不同，常见的建库方式有以下几种：

常规法DNA建库

传统DNA建库具有适用样品类型广泛，文库转化率高的特点，是目前较常用的DNA二代测序文库构建方法。该方法主要通过TA克隆的方式连接接头，具体建库流程如下：

✼ 待测序DNA片段化

✼ 片段化的DNA进行末端修复和加A尾

✼ 修复后的片段进行接头连接

✼ 文库扩增

乐动平台(中国)目前已推出2款分别适用于Illumina和MGI平台的传统文库构建试剂盒，适用于全基因组、靶基因、宏基因组等多种测序。

➣ TransNGS^® DNA Library Prep Kit for Illumina^®

该产品针对Illumina 高通量测序平台开发，适用于将1 ng-1 μg 片段化的dsDNA 高效快速地转化为测序文库，具有文库转化效率高，适用样本类型广泛的特点。

● 文库构建原理示意图

● 与竞品的比较

使用TransGen 和Company V 的DNA 建库试剂盒对超声打断的HeLa 细胞Smear DNA 进行文库构建，投入量为1 ng、10 ng、100 ng 和1000 ng，TransGen 产品在建库产量方面优于竞品，文库峰型与竞品一致。对文库进行测序分析，TransGen 在Q20/Q30、GC 含量、Duplicates、比对率、GC 分布等指标均与竞品无明显差异，测序结果与竞品高度相关（R2>0.95）。

      ✧文库产量（分选后）

✼文库峰型

✼测序数据质量

✼ GC分布

✼ 染色体覆盖深度分布

✼ 相关性分析

➣ TransNGS^® DNA Library Prep Kit for MGI^®

该产品是针对MGI 高通量测序平台开发的文库试剂盒，具有文库转化效率高，适用样本类型广泛，数据质量高的特点。

● 文库构建原理示意图

● 与竞品的比较

✼ 不同起始样本量文库产量比较

分别使用TransGen和Company V产品，对来源于人HeLa细胞的不同起始量基因组DNA片段化后的dsDNA进行相同循环数的建库。结果表明，TransGen产品对1 ng-1 μg起始样本量均有较高的建库效率。

✼ 测序结果比较

分别使用TransGen和Company V产品，对来源于人Hela细胞的不同起始量基因组DNA片段化后的dsDNA进行建库测序及分析。 结果表明，TransGen产品在数据质量、GC分布及相关性方面与竞品相比，性能一致。

✧ 测序结果比较

✧ GC分布

转座酶法建库

与传统文库制备必须进行DNA片段化、末端修复和接头连接相比，体外转座技术不仅快速、操作简便，而且建库所需DNA量少，5分钟内即可同时完成DNA片段化和接头连接。

针对不同的起始量样品，乐动平台(中国)推出3款Tn5建库产品

✼ TransNGS^® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 50 ng DNA)

✼ TransNGS^® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 5 ng DNA)

✼ TransNGS^® Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina^® (for 1 ng DNA)

● 文库构建原理示意图

●产品稳定性

以5 ng人基因组DNA为样品，分别使用不同批次产品构建全基因组短片段文库，扩增9个循环，产物经1.0×DNA磁珠（TransGen, EC411）纯化（不进行文库片段长度分选），文库经Agilent高灵敏DNA芯片鉴定，片段长度分布一致，主要分布在200-2000 bp之间 ；使用Qubit检测文库浓度，计算文库产量。由峰型的一致性与产量的一致性上可知，产品批次间的稳定性好。

✼文库峰型与产量

● 与竞品的比较

以5 ng人基因组DNA为样品，分别使用TransGen和Company V产品构建全基因组短片段文库并进行文库测序及分析，结果表明，TransGen 产品在文库峰型与产量、测序数据质量、GC 分布与相关性方面与竞品相比，性能一致。

✼ 文库峰型与产量

✼ 测序数据质量

✼GC分布

✼ 相关性分析

片段化酶法建库

相对于超声打断法，片段化酶法打断操作更为简单，转管次数更少，样本损耗量也更低，可以兼容更低的样本起始量。最重要的是，酶解法打断不需要使用专门的仪器和耗材，能大幅降低建库成本，因此乐动平台(中国)最新推出了2款适用于Illumina和MGI平台的片段化酶法建库试剂盒。

➣ TransNGS^® Fragmentase DNA Library Prep Kit for Illumina^®

该产品适用于将起始量为1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地构建成DNA文库，一步完成DNA片段化、末端修复以及末端加A反应，产物无需纯化，可直接用于接头连接。

● 文库构建原理示意图

●与竞品的比较

使用TransGen 和Company V 产品对 HeLa 细胞基因组进行酶切法DNA 建库。结果表明， TransGen 产品在投入量0.1 ng、1 ng、10 ng、100 ng 条件下建库所得文库峰型一致。在相同投入量（50 ng）条件下，通过调整片段化时间，可灵活调整DNA 片段长度，与Company V 产品相比，TransGen 产品文库峰型随时间改变更灵敏。在投入量1 ng、10 ng、100 ng、1000 ng 条件下建库，TransGen 产品Company V 产品相比产量一致或更优。

✼ 文库峰型

✼ 不同投入量建库产量

✼  测序结果比较

     使用TransGen 和Company V 产品对不同动物、植物和微生物样本建库测序及分析，结果表明，TransGen 产品在测序质量、比对率、覆盖度、GC 分布等指标上与竞品没有明显差异。    

➣ TransNGS^® Fragmentase DNA Library Prep Kit for MGI^®

该产品适用于将起始量为1 ng-1 μg的dsDNA高效快速地构建成DNA文库，一步完成DNA片段化、末端修复以及末端加A反应，产物无需纯化，可直接用于接头连接。

● 文库构建原理示意图

● 与竞品的比较

使用TransGen 和竞品Company V 产品对HeLa 细胞基因组建库，TransGen 产品可通过调整酶切时间获得不同插入片段长度的文库，不同投入量0.1ng、1 ng、10 ng、100 ng 所构建文库峰型一致，与Company V 产品相比产量持平或有一定优势。

✼ 文库峰型

✼ 建库产量

✼  测序结果比较

    选取动物、植物和微生物样本建库测序，测序质量和竞品持平。

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